光学显微镜使用可见光进行照明,用光学透镜进行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相机进行观察.基本的明场照明显微镜由光源、目镜、物镜、载物台、聚光镜、光圈等部件组成.收到衍射效应的限制光学显微镜的分辨率极限, 其中聚光镜NA 是数值孔径(Numerical Aperture)为物镜与样品间介质折射率以及孔径角正弦值的乘积是光学显微镜重要的参数之一.阿贝极限将光学显微镜的分辨率限制在约200纳米处. 为了提高显微镜的成像素质,扩展应用范围,光学显微镜经过不断的发展改进,已经成为现在产品品质保证必要一种光学设备.

光学显微镜的成像手段:

普通宽场成像 (Wide field) :光学显微镜基本的成像光路全内反射荧光(TIRF):利用光在介质界面发生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只对样品表面200nm 左右深度内进行成像,隔绝来自焦外光线的干扰.

共聚焦(Confocal):利用空间针孔对焦外光线进行隔绝,对样品进行逐点扫描成像,大大提高z轴分辨率..

多光子(Multi-Photon):利用长波长的光波绕射能力强,穿透能力高的特性,让荧光分子同时吸收多个长波长光子激发短波长荧光,从而实现使用较低能量的光照来对厚样品成像.目前成像的深度已经达到毫米级别.

光片 (Light sheet):对垂直于物镜光轴的切片进行照明,避免了对焦外部分样品的照明,大大提高z轴分辨率,同时相对 confocal 成像速度更高.

结构光 (Structured light):将照明光进行正弦调制或其它形式的调制形成结构光照明,与样品表面形成摩尔纹,使得一部分高频信息能够被观察到.这种方法高能够提升两倍的分辨率,属于一种超分辨技术.

受激发射损耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):荧光显微镜中激发光由于衍射效应,在样品上形成的是一个亮斑,亮斑内的荧光分子均被激发产生荧光,STED在激发光上嵌套一个环形光,使对应环形区域的分子发生受激辐射而不产生荧光,只有中心区域分子产生荧光,从而突破衍射极限限制的分辨率.STED的分辨率可以达到30nm左右.

  随机光学重构 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):随机激发单个荧光分子,对其光斑进行拟合得到中心分子的位置,不断随机激发分子并将得到的图案叠加,得到超越衍射极限分辨率的图像,STORM的分辨率可以达到20nm左右.